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        組織病理切片的制作過程
        發布時間:2014-1-16
         

        1.取材組織取材的方法是制作切片的一個重要程序,根據教學、科研及外檢的具體要求取自人體(外科手術切除標本、活檢標本、尸檢標本)或動物,并確定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖學、組織學、病理學的基本理論知識,還要掌握實際操作技術,每個組織器官的取材都有一定的部位和方法,不能任意切取組織作為制片材料,不然,無法達到教學、科研和臨床診斷的目的,具體要求如下:

        (1)材料新鮮:取材組織愈新鮮愈好,人體組織一般在離體后,動物組織在處死后迅速固定,以保證原有的形態學結構。

        (2)組織塊的大?。核〗M織塊較理想的體積為2.0cm×2.0cm×0.3cm,以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內部,但根據制片材料和目的不同,組織塊的較理想體積也不同,如制作病理外檢、科研切片,其組織塊可以薄取0.1~0.2cm即可,這樣可以縮短固定脫水透明的時間,若制作教學切片厚取0.3 ~0.5cm,這樣可以同一蠟塊制作出較多的教學切片。

        (3)勿擠壓組織塊: 切取組織塊用的刀剪要鋒利,切割時不可來回銼動。夾取組織時切勿過緊,以免因擠壓而使組織、細胞變形。

        (4)規范取材部位: 要準確地按解剖部位取材,病理標本取材按照各病變部位、性質的不同,根據要求規范化取材。

        (5)選好組織塊的切面:根據各器官的組織結構,決定其切面的走向??v切或橫切往往是顯示組織形態結構的關鍵,如長管狀器官以橫切為好。

        (6)保持材料的清潔:組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等,可用水沖洗干凈后再放入固定液中。

        (7)保持組織的原有形態:新鮮組織固定后,或多或少會產生收縮現象,有時甚至完全變形。為此可將組織展平,以盡可能維持原形。

        2.固定

        (1)小塊組織固定法:這是最常用的方法,從人體或動物體取下的小塊組織,須立即置入液態固定劑中進行固定,通常,標本與固定液的比例為1:4~20,但組織塊不宜過大過厚,否則固定液不能迅速滲透。故取組織塊的大小一般為2.0cm×2.0cm×0.3cm。

        (2)注射、灌注固定法:某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內部,或需要對整個臟器或整個動物體進行固定。這時宜采用注射固定或灌注固定法。將固定液注入血管,經血管分支到達整個組織和全身,從而得到充分的固定。

        (3)蒸汽固定法:比較小而厚的標本,可采用鋨酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片,則應在血片未干燥前采用鋨酸或甲醛蒸汽接觸固定。

        最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。

        3.脫水透明標本經過固定和沖洗后,組織中含有較多的水分,必須將組織塊內的水分置換出來,這一過程叫做脫水。無論是用石蠟切片,還是用火棉膠切片,都必須除去組織中所含水分,因含水組織與石蠟、火棉膠等包埋材料不相容,常用的脫水劑為一系列不同濃度的乙醇。

        脫水的步驟是:80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2小時,此過程可用脫水機自控完成。

        丙酮也是一種脫水能力很強的脫水劑,但因其脫水能力很強,對組織有劇烈收縮作用,在制作科研、教學切片時一般不用該試劑。因乙醇、丙酮等不溶于石蠟,還要經過一個能溶于石蠟的溶劑替代過程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、三氯甲烷、水楊酸甲酯等。

        4.浸蠟、包埋

        (1)使石蠟浸入組織中,取代組織中含有的透明劑。

        (2)包埋:將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中,石蠟凝固后,組織即被包在其中,稱蠟塊,此過程稱為包埋。

        5.切片和貼片

        (1)修整蠟塊:可視其組織的大小,在組織邊緣約0.1~0.2cm處,切去余蠟部分,否則易造成組織皺縮不平。

        (2)準備好切片用具:切片刀、毛筆、眼科鑷子(彎)、漂烘溫控儀

        (3)安裝蠟塊:將修好的蠟塊安裝在金屬或木制持蠟器上。

        (4)安裝切片刀:將切片刀安裝在切片機的刀臺上,把刀臺上的緊固螺絲旋緊,使切片時不產生振動,能保持一定的切片厚度。

        (5)切片的厚度:切片機的厚度調節器上刻有0~50μm或0~25μm,可任意選擇其厚度,石蠟切片的厚度一般在4~6μm。

        (6)切片

        (7)鋪片:用眼科鑷子鑷起蠟帶輕輕平鋪在40~45℃的水面上,借水的張力和水的溫度,將略皺的蠟帶自然展平。

        (8)貼片、烘片:待切片在恒溫水面上充分展平后,將蠟片撈到載玻片的中段處傾去載玻片上的余水,置入60~65℃恒溫箱內或切片漂烘溫控儀的烘箱內烤片15~30分鐘,脫去溶化組織間隙的石蠟。

        6.染色和封片常用的染色方法是蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin)染色法,簡稱H.E染色法。這種方法對任何固定液固定的組織和應用各種包埋法的切片均可使用。蘇木素是一種堿性染料,可使組織中的嗜堿性物質染成藍色,如細胞核中的染色質等;伊紅是一種酸性染料,可使組織中的嗜酸性物質染成紅色,如多數細胞的胞質、核仁等在H.E染色的切片中均呈紅色。

        H.E染色程序如下:脫蠟、脫苯、復水、染色、脫水、透明、封固

        常規蘇木素染色中的對比染色是用伊紅,近年來在英、美國家的一些實驗室則采用焰紅(phloxine),此外也有用桔黃G(OrangeG)、比布里希猩紅(Biebrich scarlet)、波爾多紅(Bordeaux red)等作為對比染色。伊紅為染胞質、膠原纖維、肌纖維、嗜酸性顆粒等常用的染料。

         
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