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        石蠟切片制作
        發布時間:2014-1-21
         

        一、蘇木精-伊紅對染法 

        一、器材及試劑: 1. 器材: 
        切片刀,切片機,恒溫箱,蠟杯,酒精燈,解剖刀,解剖剪,解剖盤,培養皿,鑷子,單面刀片,毛筆,包埋盒,染色缸,蓋玻片,載玻片,玻片盤,樹膠,樹膠瓶,顯微鏡,溫度計,臉盆,水浴鍋。 
        切片機,切片刀,溫臺,恒溫箱,解剖刀,鑷子,剪刀,解剖針,單面刀片,小臺木,灑精燈,包埋紙盒,染色缸,燒杯,水盆,熔蠟爐,蠟杯。 2.試劑: 
        中性福爾馬林固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、蘇木精染液, 1%伊紅酒精溶液,1%鹽酸酒精溶液,甘油蛋白粘片劑,中性樹膠。 卡諾(Carnoy)固定液,埃利希蘇木精染液,1%伊紅酒精溶液,1%鹽酸乙醇液,各級酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,甘油蛋白粘片劑,中性樹膠。 3. 材料: 
        鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、莖、葉等。 二、實驗原理: 
        石蠟切片是最基本的切片技術,冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法(簡稱H.E.對染法)是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛,對組織細胞的各種成分都可著色,便于全面觀察組織構造,而且適用于各種固定液固定的材料,染色后不易褪色可長期保存。經過HE染色,細胞核被蘇木素染成藍紫色,細胞質被伊紅染色呈粉紅色。 三、試劑配法: 1.中性甲醛固定液: 
               甲醛(37%-40%,市售,本所購買即為此濃度)  100mL        磷酸氫二鈉                                 6.5 

         

         


         
         
         磷酸二氫鉀(鈉)                           4g        
        雙蒸水                                    900mL                              
        2.蘇木精、伊紅染色液為碧云天產品 3.1%鹽酸乙醇液 
        鹽酸 1份 70%酒精 100份 
        4.甘油蛋白貼片劑: 
        蛋白 50 ml 甘油 50 ml 
        水楊酸鈉(防腐劑) 1g 
        配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中,去蛋黃留下蛋白,用玻棒調打成雪花狀泡沫,然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中,經數小時或一夜,即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加等量的甘油,稍稍振搖使兩者混合。最后加入防腐劑(水楊酸鈉)作防腐用??杀4鎺讉€月。 四、實驗步驟: 1.取材 
        頸椎脫臼法處死小鼠,打開腹腔,剪取肝組織(或其他組織)。 
        切取的組織塊不宜太大,以利于固定劑穿透,通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織,切成一小塊2-3mm厚。 
        注意事項: 
        (1)取材動作要迅速,不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。 (2)切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇,盡可能不要損傷所需要的部分。 
        2.固定 
        將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下,立即投入中性福爾馬林固定液中固定,固定30-50min。 
        注意事項: 
        (1)一般固定液,都以新配為好,配好后應貯存在陰涼處,不宜放在日光下,以免引起化學變化,失去固定作用。 
        (2)有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定時就沒有作用了。  
        (3)固定材料時,固定液必須充足,一般為材料塊的20~30倍,有些水分多的材料,中間應更換1-2次新液。 
        (4)材料固定完畢后,保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里,同時在容器外上標簽,并隨同材料在溶液中投入相應的標簽,以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字,應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。 
        3. 洗滌 
        材料經固定后,流水沖洗,數小時或過夜。 4. 脫水 
        材料依次經70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水,各30min,再放入95%、100%各2次,每次20min。各 
        注意事項: 
        (1)脫水必須在有蓋的玻璃品中進行,防止吸收空氣中的水分。 
        (2)在更換高一級的脫水劑時,最好不要移動材料以免損壞,可用吸管吸出器皿中的脫水劑,再用吸水吸盡器皿內剩余液,然后于皿中加入高一級脫水劑。 
        (3)在低濃度酒精中,每級停留不宜太長,否則易使組織變軟,助長材料的解體。 (4)在高濃度或純酒精中,每級停留的時間也不宜太長,否則會使組織變脆,影響切片。 (5)如需過夜,應停留在70%酒精中。 
        (6)脫水必須徹底,否則不易透明,甚至使透明劑內出現白色混濁現象 
        5.透明 
        純酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min(至透明為止)。 
        由于乙醇與石蠟不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟,所以脫水后還要經過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時,光線可以透過,組織呈現出不同程度的透明狀態。 透明注意事項 
        (1)使用透明劑時,要隨時蓋緊蓋子,以免空氣中的水分進入。 
        (2)更換每級透明劑,動作要迅速,一方面為了不使材料塊干涸,另一方面能避免吸收濕氣。 
        (3)在透明過程中, 如果材料周圍出現白色霧狀,說明材料中的水未被脫凈,應退回純酒精中重新脫水,然后再透明。 

         
        6.透蠟 
        放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min(有嗎 ?),再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘。 
        透蠟的目的是除去組織中的透明劑(如二甲苯等),使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據組織大小而定。透蠟應在恒溫箱內進行,并保持箱內溫度在55-60℃左右,注意溫度不要過高,以免組織發脆。一般置于恒溫箱0.5h。 透蠟注意事項 
        (1)盡量保持在較低溫度中進行,以石蠟不凝固為度; (2)透蠟溫度要恒定,不可忽高忽低; 
        (3)操作要迅速,力求在最短的時間內完成石蠟透入過程,以免引起組織變硬、變脆、收縮等。 
        7. 包埋 
        包埋時,用鑷子夾取石蠟模子(金屬質地)在酒精燈上稍加熱,放在平的桌面上,從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯,倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱,夾取材料將切面朝下放入蠟模中,排列整齊。再放上包埋盒,輕輕倒入熔蠟。 8. 切片 
        ①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。 ②將切片刀固定在刀夾上,刀口向上。 
        ③搖動推動螺旋,使石蠟塊與刀口貼近,但不可超過刀口。 
        ④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置,刀片與石蠟切片約成15度左右。 ⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度,一般為4-10微米。 
        ⑥一切調整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉輪,讓蠟塊切成蠟帶,左手持毛筆將蠟帶提起,搖轉速度不可太急,通常以40-50r/min。 
        ⑦切成的蠟帶到20-30cm長時,右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起,以免卷曲,并牽引成帶,平放在蠟帶盒上,靠刀面的一面較光滑,朝下,較皺的一面朝上。 ⑧用單面刀片切取蠟片一小段,放在載玻上加水一滴,置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。 
        ⑨切片工作結束后,應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟,把切片機擦拭 
         
        干凈妥為保存。 9. 展片、貼片 
        打開水浴鍋,使水溫維持在40-45℃,另準備30%乙醇溶液。 ① 切片時,將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。 
        ② 用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶,放在乙醇溶液的水面上,使切片展開。 ③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開,用一個載玻片將切片完整,已展開的切片撈至溫水中,使之充分展開。 
        ④ 另取潔凈的載玻片,撈起展開的切片,使其位于切片1/3處,另一端(磨邊,粗糙的一端)磨面上標記或貼上標簽,放于切片架上。 10. 脫蠟復水 
            將水浴鍋溫度調至60℃,待水溫控制在60℃時,將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內,放入水浴鍋中,蓋上蓋子(可密封),30min至蠟熔化。 
        之后,石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3-5min,再放入蒸餾水中3min。 11. 染色 
        切片放入蘇木精中染色約10-30min。 
        染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低,適當縮短或延長。室溫高時促進染色,染色時間可短些,否則可適當延長時間,冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。 
        12.水洗 
        用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍(或放入堿性水中也可),但要注意流水不能過大,以防切片脫落。 13.分化 
        將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色,約2秒至數十秒鐘。見切片變紅,顏色較淺即可。 

        14.漂洗 
        切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。

         15.脫水Ⅰ 
        切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。 

        16、復染 

         

         

         

         

         


         

         
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